Para el ensayo se recolectaron hembras ingurgitadas de R. microplus de vacas de la raza Holstein en la finca “El Jobo” en la provincia Artemisa, municipio Caimito, que no habían recibido tratamiento biológico. En el laboratorio, las garrapatas se colocaron en placas de Petri hasta la puesta de los huevos, pasado de cinco a siete días fueron inoculados por inmersión durante un minuto en suspensiones conidiales del aislado Ma-005 de M. anisopliae con las concentraciones siguientes: 1,1x10⁸, 1,1x10⁷, 1,1x10⁶, 1,1x10⁵ ,1,1x10⁴ y 1,1x10³ conidios mL^-1, y con L. lecanii cepa Y-57 a una concentración de 1,6 x 10⁸ conidios mL^-1, posteriormente se colocaron de 20 a 25 de ellos en frascos de vidrio de 30 mL tapados con cinta de laboratorio (Parafilm “M”^®) perforada con una fina aguja para permitir el intercambio gaseoso.

A los 30 días se evaluó el número de huevos eclosionados y determinó el porcentaje de los mismos. Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con ocho tratamientos y cuatro repeticiones. Los resultados obtenidos fueron transformados según la expresión asen (p)½ y procesados mediante un análisis de varianza de clasificación simple comparándose las medias a través de la prueba de Tukey con un nivel de significación del 5 % (SAS Institute, 2009).

Los procedimientos utilizados para el montaje, incubación y procesamiento de los datos fueron similares a los descritos en el ensayo anterior, excepto que las neolarvas tenían de siete a 10 días y la evaluación del porcentaje de mortalidad se realizó a los siete y 14 días. El criterio de mortalidad de dichas neolarvas fue que al ser estimuladas con un pincel no se movían.

El análisis estadístico realizado muestra diferencias altamente significativas entre los tratamientos El menor porcentaje de huevos eclosionados se registró en la mayor concentración del aislado Ma-005 a 1,1 x10⁸ conidios mL^-1 obteniendo un valor 9,93% no difiriendo de la cepa de L. lecanii a la concentración de 1,6 x10⁸ conidios mL^-1 con un valor de 10,41%, el mayor porcentaje de huevos eclosionados se evidenció en la menor concentración del aislado Ma-005 sin diferencias significativas con el control (Tabla 1).

Alemán et al. (2015) demostraron que los hongos utilizados causan mortalidad en las diferentes fases evolutivas del ectoparásito, y ocasionan una disminución de la tasa de eclosión en los huevos parasitados. También, Narladkar et al. (2015) informaron el gran efecto ovicida de M. anisopliae.

Los análisis estadísticos muestran que existen diferencias altamente significativas en los momentos evaluados. En la Tabla 2, se observa que a los siete días la mortalidad es mayor en la concentración más alta de 1,1x10⁸ del aislado Ma-005 obteniéndose un 55,76 %, no difiriendo de la cepa de L. lecanii a una concentración de 1,6 x 10⁸ con valor de 57,21 % de mortalidad y difiriendo sobre el resto de los tratamientos de 10⁷ a 10³. El menor porcentaje de mortalidad se evidenció en la menor concentración sin diferencia con el control. A los 14 días, con resultados similares se evidencia que la mayor concentración de M. anisopliae de 10⁸ no mostró diferencias en la concentración siguiente y la cepa de L. lecanii, pero si difiriendo de los restantes tratamientos, por otra parte, el porcentaje menor de mortalidad se evidenció en la concentración más baja del aislado Ma-005, sin diferencia respecto al control.

Tabla 1

Concentración (conidios mL-1)	Huevos eclosionados (%)
	X orig.	X. transf.
Control	97,04	0,5167 a
Ll 1,6 x 108	10,41	0,2692 f
Ma-005 1,1 x 108	9,93	0,2672 f
Ma-005 1,1 x 107	28,23	0,3319 e
Ma-005 1,1 x 106	45,32	0,3841 d
Ma-005 1,1 x 105	58,91	0,4220 c
Ma-005 1,1 x 104	71,97	0,4557 b
Ma-005 1,1 x 103	91,39	0,5033 a
C.V. (%)		4,56
ESx		0,009***

Medias con letras iguales, no difieren significativamente, según Tukey (p≤ 0,05)

Sobre los huevos y neolarvas infectados se desarrolló un micelio profuso, de color blanco que con el proceso de esporulación se tornaron de color verde oliváceo.

Los resultados obtenidos concuerdan con Lonc et al. (2014) que refieren que las mayores concentraciones de hongos entomopatógenos poseen una mayor cantidad de conidios que se adhieren a la cutícula de la garrapata aumentando la probabilidad de que propágulos infectivos penetren y se multipliquen dentro del cuerpo de estas ocasionándoles daño, deficiencias nutricionales o liberación de toxinas que disminuyan la supervivencia. Rodríguez et al. (2014) demuestran buenos resultados sobre larvas y huevos de R. microplus utilizando M. anisopliae.

Tabla 2

Concentración (conidios mL-1)	Mortalidad (%)
	7 días		14 días
	X orig.	X. transf.	X orig.	X. transf.
Control	0,00	0,2255 e	4,36	0,2444 e
Ll 1,6 x 108	57,21	0,4162 a	80,27	0,4760 a
Ma-005 1,1 x 108	55,76	0,4125 a	81,80	0,4803 a
Ma-005 1,1 x 107	38,57	0,3643 b	69,52	0,4496 ab
Ma-005 1,1 x 106	30,95	0,3400 bc	52,69	0,4047 bc
Ma-005 1,1 x 105	21,00	0,3075 c	43,75	0,3789 c
Ma-005 1,1 x 104	10,75	0,2705 d	38,59	0,3611 c
Ma-005 1,1 x 103	6,30	0,2524 de	21,07	0,3083 d
C.V. (%)		6,92		8,35
ESx		0,011***		0,016***

Medias con letras iguales, dentro de cada columna, no difieren significativamente, según Tukey (p≤ 0,05