COMUNICACIÓN BREVE

Actinomicetos antagonistas a Colletotrichum gloeosporioides Penz. en el cultivo de limón en Villa Clara, Cuba

Actinomycetes antagonists to Colletotrichum gloeosporioides Penz. in lemon cultivation in Villa Clara, Cuba

Miriam Díaz Díaz¹* https://orcid.org/0000-0001-9862-3385

Alexander Bernal Cabrera² https://orcid.org/0000-0002-1492-9510

Ricardo Medina Marrero¹ https://orcid.org/0000-0001-5561-5481

Milagros García Bernal¹ https://orcid.org/0000-0002-3350-7284

Divaldo Alfredo Augusto Henriques¹ https://orcid.org/0000-0002-9433-1577

¹Centro de Bioactivos químicos (CBQ), Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuaní km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba, CP 54830
²Departamento de Agronomía, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuaní, km 5 ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba, CP 54830
³Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Central "Marta Abreu" de Las Villas, Carretera a Camajuaní, km ½, Santa Clara, Villa Clara, Cuba, CP 54830

RESUMEN

El cultivo de limón (Citrus aurantifolia) es susceptible al ataque de fitopatógenos, que son controlados con moléculas químicas. Una alternativa para revertir los daños ecológicos causados por estas sustancias químicas es el control biológico. El objetivo del presente estudio fue seleccionar cepas de actinomicetos con actividad antagónica a Colletotrichum gloeosporioides. Se determinó la actividad antagónica in vitro de 181 cepas de actinomicetos, pertenecientes al cepario del Centro de Bioactivos Químicos, contra C. gloeosporioides; así como, la actividad enzimática extracelular de las cepas que exhibieron mejor efecto antagonista. Del total de cepas evaluadas, 62 mostraron capacidad antagónica manifestada contra C. gloeosporioides, indica que tienen el potencial para ser evaluadas in vitro e in vivo contra diferentes fitopatógenos del limón.

Palabras clave: actividad enzimática, antracnosis, Biocontrol, Citrus aurantifolia, Inhibición

ABSTRACT

The lemon (Citrus aurantifolia) crop is susceptible to attack by phytopathogens, which are controlled with chemical molecules. An alternative to reverse the ecological damage caused by these chemicals is biological control. The aim of this study was to select strains of actinomycetes with antagonistic activity to Colletotrichum gloeosporioides. It was determined the antagonistic activity in vitro of 181 strains of actinomycetes, belonging to the Chemical Bioactive Center's strain, against C. gloeosporioides; as well as, the extracellular enzymatic activity of the strains that showed better antagonistic effect. From the total of evaluated strains, 62 showed antagonistic capacity manifested against C. gloeosporioides, indicating that they have the potential to be evaluated in vitro and in vivo against different lemon phytopathogens.

Keywords: enzyme activity, anthracnose, Biocontrol, Citrus aurantifolia, Inhibition

El limón (Citrus aurantifolia L.) es uno de los principales cultivos perennes en la Provincia de Matanzas, la cosecha de limón alcanzó en el 2014 las 1 300 toneladas y llegó a promediar nueve toneladas por hectárea. La producción citrícola en nuestro país está limitada por problemas fitosanitarios, especialmente antracnosis (Colletotrichum gloeosporioide); la principal enfermedad fungosa a nivel mundial, causando pérdidas económicas en pre y poscosecha, principalmente en regiones con temperatura y humedad relativa elevada (Prusky et al. 2000; Rhaiem y Taylor, 2016).

El control biológico de enfermedades ha tomado interés desde hace algunas décadas por detectar microorganismos benéficos con potencial de ser usados como agentes de biocontrol para reducir las poblaciones de fitopatógenos y disminuir las aplicaciones de productos químicos (Ferreira et al., 2020). Los actinomicetos controlan diferentes agentes patógenos a través de la producción metabolitos secundarios y primarios como antibióticos y enzimas extracelulares (Ding et al., 2019); con capacidad de inhibir el crecimiento micelial, la germinación de esporas de hongos fitopatógenos y sobrevivir en la superficie de las frutas por largos períodos de tiempo (Qi et al., 2019).

Con base en lo anterior el objetivo del presente trabajo fue seleccionar cepas de actinomicetos como agentes de biocontrol de C. gloeosporioides. Para determinar la actividad antagonista in vitro se sembraron las 181 cepas de actinomicetos previamente identificadas en cajas Petri de 90 mm de diámetro con medio de cultivo Agar Caseína Almidón (ACA) a pH 7, para luego incubarse a 28 °C por siete días en una cámara de crecimiento (Memmert), hasta observar crecimiento del actinomiceto. El hongo fitopatógeno se seleccionó debido a su incidencia en la región productora de limón, se sembró en Agar Papa Dextrosa (PDA) e incubó a 25 °C, tres días en una cámara de crecimiento (Memmert) previo a la realización del ensayo.

Cada antagonista se sembró de acuerdo con Evangelista-Martínez et al. (2020), mediante fragmentos de la colonia de 6 mm de diámetro, los cuales se colocaron en los cuatro puntos cardinales de la caja de Petri con PDA, y se incubaron a 28 °C por 3 días. Posteriormente fue colocado un fragmento con micelio de la colonia del hongo fitopatógeno en el centro de cada placa y se incubó de nuevo bajo las mismas condiciones.

Como tratamiento control, se sembró el hongo fitopatógeno en el centro de la caja de Petri con PDA, el crecimiento radial de la colonia de Colletotrichum gloesporoides confrontado ante cada actinomiceto y del control se midió cada 24 h. El día en que el control lleno la caja de Petri, se registró la inhibición de los actinomicetos (Evangelista-Martínez et al., 2020). Para determinar la actividad antifúngica, la variable de respuesta que se evaluó fue el Porciento de Inhibición de Crecimiento Radial (PICR) por efecto de los distintos actinomicetos, de acuerdo con la escala ordinal propuesta por (Salazar et al., 2012). Posteriormente, se seleccionaron las cepas que presentaron mayor PICR para determinar cualitativamente la actividad enzimática extracelular quitinolítica y celulítica.

El procesamiento estadístico de los datos se realizó con el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 22.0.0 para Windows. Se verificaron los supuestos de normalidad mediante la prueba de Shapiro Wilk. Se realizó una comparación de medias, mediante la prueba de HSD Tukey. En todos los casos las diferencias se consideraron significativas para un valor de p<0,05.

El ensayo de antagonismo in vitro mostró que, de las 181 cepas de actinomicetos evaluadas, 62 cepas mostraron actividad contra C. gloeosporioides en placas de ACA tras siete días de incubación. En la Tabla 1 se muestran las cepas de actinomicetos con los mejores resultados de la actividad antagónica frente a C. gloeosporioides.

Tabla 1. Actividad antagónica in vitro de cepas de actinomicetos frente a C. gloeosporioides aislado de limón

Similares resultados obtuvieron Soares et al. (2016) cuando informaron que el aislado de actinomiceto AC 26, por su actividad antagónica en el medio de crecimiento y la producción de metabolitos secundarios, fue el aislado más eficiente para controlar el crecimiento del micelio de los hongos fitopatógenos Curvularia eragrostides y C. gloeosporioides.

Igualmente, Gu et al. (2020) reportaron que la cepa Streptomyces deccanensis QY-3 mostró una buena actividad antagónica contra C. gloeosporioides con una tasa de inhibición del 86,6 %.

De las 62 cepas que mostraron actividad contra C. gloeosporioides, 31 de ellas fueron seleccionadas según el PICR para determinar la actividad enzimática extracelular quitinolitica y celulolitica; y de ellas, 25 fueron capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono, las que mostraron crecimiento y presentaron una zona de hidrólisis alrededor de la colonia, indicativa de actividad quitinolítica. De estas 25 cepas seleccionamos, las 6 cepas con mayor actividad se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Actividad Quitinolítica de 6 cepas de actinomicetos en medio agar quitina coloidal

Medias con letras desiguales en una misma columna difieren según prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con el test de Mann Whitney para p< 0,05

Similares resultados obtuvieron Das et al. (2017) quienes evaluaron, aproximadamente 260 cepas de actinomicetos aislados de diversos hábitats ecológicos y los examinaron para la producción de quitinas por el método de ensayo en placa. El diámetro de las zonas de hidrólisis osciló entre 8 y 16 mm.

La actividad celulolítica se evidenció con las zonas de aclaramiento alrededor de las colonias cuando se utilizó como revelador el rojo Congo al 1 % (p/v). Las cepas EsFe-12, ESFe-5, Plat-2, ESFe-13, Plat-3 y Plat-1 (Tabla 3) fueron las cepas que presentaron halos de hidrólisis significativamente más grandes que el resto de las cepas evaluadas; siendo la cepa ESFe-12 la que presentó los valores significativos más altos.

Tabla 3. Actividad celulolítica de 6 cepas de actinomicetos en medio conteniendo celulosa

Medias con letras desiguales en una misma columna difieren según prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con el test de Mann Whitney para p< 0,05

Similares resultados mostraron los estudios realizado por Nauanova et al. (2018), donde el 41,7 % de los actinomicetos aislados poseían una alta capacidad celulítica y el 30,6 % de las cepas descomponen débilmente la celulosa nativa.

Del total de cepas evaluadas, Plat-2 y ESFe-12 mostraron resultados más promisorios en cuanto a la actividad antagónica in vitro frente a C. gloeosporioides y enzimática extracelular quitinolítica y celulolítica. Similares resultados obtuvieron Song et al. (2020) cuando determinaron que la cepa JT-2F fue capaz de producir proteasas y celulasas para degradar los componentes proteicos y celulósicos de las paredes celulares de C. dematium, respectivamente. Por otra parte, Yang et al. (2019) aislaron e identificaron y demostraron que S. corchorusii, tenía una actividad antagónica de amplio espectro contra varios patógenos vegetales fúngicos, como Fusarium oxysporum f. sp. niveum, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Rhizoctonia solani, P. capsica, Botryosphaeria dothidea.

CONTRIBUCIÓN DE CADA AUTOR

Miriam Díaz Díaz: diseñó la investigación, recopiló los datos, escribió el manuscrito, y corrigió los señalamientos realizados al mismo por los árbitros y editores.

Alexander Bernal Cabrera: contribuyó a la organización, análisis, síntesis de los datos obtenidos y procesados en la investigación; así como a la revisión crítica del manuscrito.

Ricardo Medina Marrero: contribuyó a la organización, análisis, síntesis de los datos obtenidos y procesamiento de los mismos en la investigación.

Milagros García Bernal: contribuyó a la organización, análisis y preparación de la investigación.

Divaldo Alfredo Augusto Henriques: contribuyó en la preparación del trabajo.

CONFLICTOS DE INTERESES

Los autores manifestamos que no existen conflicto de intereses ni argumentos que invaliden la publicación del manuscrito.

BIBLIOGRAFíA

DAS, P., KUMAR, P., KUMAR, M., et al. 2017. Purification and molecular characterization of chitinases from soil actinomycetes. African Journal of Microbiology Research, 11(27): 1086-1102.

DING, T., YANG, L. J., ZHANG, W. D. and SHEN, Y. H. 2019. The secondary metabolites of rare actinomycetes: chemistry and bioactivity. RSC advances, 9(38): 21964-21988.

EVANGELISTA-MARTÍNEZ, Z., CONTRERAS-LEAL, E. A., CORONA-PEDRAZA, L. F. and GASTÉLUM-MARTÍNEZ, É. 2020. Biocontrol potential of Streptomyces sp. CACIS-1.5 CA against phytopathogenic fungi causing postharvest fruit diseases. Egyptian Journal of Biological Pest Control, 30(1): 1-10.

FERREIRA, F. V., HERRMANN?ANDRADE, A. M., CALABRESE, C. D., et al. 2020. Effectiveness of Trichoderma strains isolated from the rhizosphere of citrus tree to control Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides and Penicillium digitatum A21 resistant to pyrimethanil in post-harvest oranges (Citrus sinensis L.(Osbeck)). Journal of Applied Microbiology.

GU, L., ZHANG, K., ZHANG, N., et al. 2020. Control of the rubber anthracnose fungus Colletotrichum gloeosporioides using culture filtrate extract from Streptomyces deccanensis QY-3. Antonie van Leeuwenhoek, 113(11), 1573-1585.

NAUANOVA, A. P., AIDARKULOVA, R. S., ANUARBEKOVA, S. S., et al. 2018. Ecology of actinomycetes in different soil ecosystems common in north kazakhstan: Assessment and genotyping. Ekoloji, 27(106): 1841-1856.

PRUSKY, D., FREEMAN, S., DICKMAN, M.B. 2000. Colletotrichum. Host specificity, pathology, and host-pathogen interaction. APS Press, The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA, 393 p.

QI, D., ZOU, L., ZHOU, D., CHEN, Y., GAO, Z., FENG, R., et al. 2019. Taxonomy and broad-spectrum antifungal activity of Streptomyces sp. SCA3-4 isolated from rhizosphere soil of opuntia stricta. Frontiers in Microbiology, doi: 10.3389/fmicb.2019.01390.

RHAIEM, A. and TAYLOR, P. W. 2016. Colletotrichum gloeosporioides associated with anthracnose symptoms on citrus, a new report for Tunisia. European Journal of Plant Pathology, 146(1): 219-224.

SOARES, A. C. F., SOUSA, C. D. S., GARRIDO, M. D. S., et al. 2016. Soil Streptomyces with in vitro activity against the yam pathogens Curvularia eragrostides and Colletotrichum gloeosporioides. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4): 456-461.

SALAZAR, E., R. HERNÁNDEZ, A. TAPIA, y GÓMEZ-ALPÍZAR, L. 2012. Identificación molecular del hongo Colletotrichum spp., aislado de banano (Musa spp) de altura en la zona de Turrialba y determinación de su sensibilidad a fungicidas poscosecha. Agron. Costarricense, 36(1):53-68. doi:10.15517/rac.v36i1.9964.

SONG, L., JIANG, N., WEI, S., et al. 2020. Isolation, Screening, and Identification of Actinomycetes with Antifungal and Enzyme Activity Assays against Colletotrichum dematium of sarcandra glabra. Mycobiology, 48(1), 37-43.

YANG, Y., ZHANG, S. W., and LI, K. T. 2019. Antagonistic activity and mechanism of an isolated Streptomyces corchorusii stain AUH-1 against phytopathogenic fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 35(9), 145.

Recibido el 20 de octubre de 2020 y aceptado el 8 de diciembre de 2020

© Autores, Revista Centro Agrícola, CIAP, UCLV, 2020