ARTICULOS GENERALES

 

Aislamiento y selección de cepas de Trichoderma y su efecto antagonista frente a Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.

 

Isolation and selection of strains of Trichoderma and its antagonistic effect against Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.

 

 

Roberto León Aguilar¹; Sonia de la C. Pino Morera²; Benedicto Martínez Coca³; Ramón Liriano Gonzalez¹ y Dania Bárbara Núñez Sosa¹.

1. Univesidad de Matanzas ¨Camilo Cienfuegos¨, Matanzas, Cuba.
2. Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal, Matanzas, Cuba.
3. Centro Nacional Sanidad Vegetal, Autopista Nacional km 24, San José, Mayabeque, Cuba.
E-mail: roberto.leon@umcc.cu

 

 

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RESUMEN

Se tomaron muestras de suelo en distintos agroecosistemas (caña y arboleda) del municipio de Colón, provincia Matanzas, donde no se había aplicado Trichoderma spp., con el objetivo de aislar, seleccionar morfológica, cultural y patogénicamente cepas autóctonas del territorio con capacidad antagónica. Para el aislamiento se siguió la metodología propuesta por el Instituto Nacional de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Se probó su antagonismo frente a Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. mediante el cultivo dual. Se obtuvieron 126 aislados de los cuales se seleccionaron 72 que cumplían con las condiciones de crecimiento, textura de la colonia y esporulación. Se iniciaron las pruebas con seis aislamientos, tres procedentes de la superficie (Tb111, Tb211 y Tc241) y tres de la profundidad de cinco cm (Tb122, Tc112 y Tc242). Dos (Tb111 y Tc241) mostraron el mayor antagonismo frente a los hongos patógenos antes mencionados. Las características de estos aislados coincide con las descritas para Trichoderma harzianum y Trichoderma longibrachiatum respectivamente.

Palabres clave: Aislamiento, antagonismo, cepas, Trichoderma spp.

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ABSTRACT

Soil samples were collected from different agro-ecosystems (sugar cain and forest) of municipality of Colón, province of Matanzas, where Trichoderma spp, was not been applied. The aim of the present work was the isolation and the morphological, cultural and pathogenic selection of autochthonous strains with antagonistic capacity. The isolation of the strain was carried out by the method suggested by the National Institute of Plant Sanitation Research. The antagonistic effect of isolated strains was tested against Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia sp. and Fusarium sp. using a dual culture. A total of 126 strains were isolated, but only 72 achieved the growth, colony texture and sporulation conditions. The tests stared with six isolations, Tb111, Tb211 and Tc241 from the surface and Tb122, Tc112 y Tc242 obtained from 5 cm. deep into the soil. Tb111 y Tc241 showed the higher antagonistic effect against the fungi pathogens species. The characteristic of the isolated strains agree with those reported for Trichoderma harzianum and Trichoderma longibrachiatum, respectively.

Key words: Isolation, antagonism, strains, Trichoderma spp.

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INTRODUCCIÓN

Dentro del grupo de los micoparásitos, los aislamientos del género Trichoderma son los más conocidos y estudiados, recomendándose para el control de hongos del suelo (Stefanova, 1997). Son antagonistas que pueden expresar su acción con más de un mecanismo (Harman, 2003), constituyendo el conocimiento de su modo de acción un factor decisivo para obtener éxito cuando se pretende utilizar en el manejo de enfermedades.

En los primeros estudios de Trichoderma spp. se observó que la actividad antagónica está relacionada con la biología de los aislamientos, lo cual se está esclareciendo con estudios recientes a nivel celular y molecular sobre la diversidad de vías y mecanismos de acción de este hongo (Harman, 2004). Es por esto que la búsqueda de cepas promisorias debe ser una tarea continua.

Desde el año 1986, el Instituto de Investigación de Sanidad Vegetal comenzó una colección de cepas de Trichoderma spp., en la que se encuentran representadas las secciones Pachybasium, Longibrachiatum y Trichoderma (Pérez, 2004), aunque a partir de 1980 se comenzaron a desarrollar tecnologías artesanales para la reproducción de aislamientos de Trichoderma. (Fernández-Larrea, 2002)

En Cuba el control de hongos fitopatógenos a través de biopreparados de Trichoderma, es uno de los métodos utilizados en el manejo integrado de plagas, sin embargo el uso de cepas comerciales presenta dificultades con su persistencia en el suelo. Por esta razón se considera importante la obtención de aislamientos nativos, mejor adaptados a las condiciones edafoclimáticas de la zona especifica donde serán aplicados.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la realización de este trabajo se seleccionaron agroecosistemas de caña y arboledas del municipio de Colón, provincia de Matanzas donde no se habían aplicado medios biológicos a base de Trichoderma.

Para la toma de muestras de suelo se siguió la metodología propuesta por Bateman y Carey (1995), para la prospección de nuevas cepas de Trichoderma.

Las muestras se tomaron en cinco puntos de cuatro campos (alejados de los bordes a 3-4m), en forma bandera inglesa y al azar. En cada punto se colectaron de 100 a 200g de suelo, a tres profundidades: en la superficie, a cinco y a 10 cm, lo más cercano al sistema radical de las plantas, vertiéndose las muestras de suelo en bolsas de nylon, las cuales se sellaron y rotularon.

Para efectuar las diluciones seriadas utilizamos la técnica descrita por Sandoval (1992). La identificación de los aislamientos estuvo basada fundamentalmente en las características culturales y morfológicas de Trichoderma cultivado sobre PDA y Agar Malta, efectuándose observaciones macro y microscópicas (microcultivos) de cada aislamiento teniendo en cuenta las descripciones que aparecen en las revisiones del género hecha por Rifai (1969) y Gams y Bisset (1998).

Para determinar la efectividad biológica de los aislamientos seleccionados se realizó la prueba de antagonismo por la técnica de cultivo dual (Bell et al., 1982).

En placas Petri de 9 cm, con medio de cultivo PDA fueron sembrados 2 discos de 5 mm de diámetro, pertenecientes, uno, a cada aislamiento de Trichoderma y el otro, a los patógenos: Rhizoctonia sp., Sclerotium rolfsii y Fusarium sp. Las observaciones fueron realizadas en un microscopio de control de fase a 400x, para describir los tipos de interacción hifal entre el patógeno y el antagonista. Se midió el crecimiento radial diariamente con una regla graduada hasta las 96 horas, evaluándose el grado del antagonismo y se determinó la velocidad de crecimiento a las 72 horas. De la selección previa, se seleccionaron los dos mejores aislamientos de los obtenidos teniendo en cuenta: esporulación homogénea, velocidad de crecimiento (al menos 7 cm de diámetro a las 72 horas) y textura compacta de las colonias, y además por su eficacia en cultivo dual comparada con una de las cepas estándares (Trichoderma harzianum_Ts3 procedente de la micoteca del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal) que se utiliza en producción.

Para la identificación de los aislados se emplearon las claves taxonómicas descritas por Rifai, 1969; Gams y Bisett, 1998.

Los aislamientos fueron sembrados en medio PDA y Agar Malta, incubándose a 25oC en condiciones de oscuridad. Se observaron las características de las colonias, además de realizar microcultivos en los que se midieron el grosor de las hifas, tamaño de los conidióforos, de las fiálides, conidios y clamidosporas.

Los datos obtenidos fueron procesados mediante análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias fueron probadas utilizando la dócima de comparación de Student Newman Weul (SNK) del paquete estadístico SPPS versión 11.5.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De las muestras tomadas en los agroecosistemas de caña y arboleda se obtuvieron 61 y 65 aislados respectivamente, para un total de 126. (tabla 1)

Al comparar el número de aislamientos totales obtenidos en los agroecosistemas seleccionados a diferentes profundidades (tabla 2), se observa que existe diferencia significativa, se obtuvo el mayor número de aislamientos a 5 cm de profundidad en el caso del agroecosistema caña de azúcar con 27, el cual difiere significativamente del resto de las profundidades. En el caso del agroecosistema arboleda el número de aislamientos se incrementó hasta 29 en la superficie del suelo, que difiere significativamente del resto de las profundidades estudiadas. El número de aislamientos totales no difiere significativamente entre la superficie y 5 cm, se considera que esté en correspondencia con factores tales como: humedad, radiación solar y oxigeno disponible. En el agroecosistema caña (con edad del cultivo hasta tres meses) la radiación solar y la temperatura sobre la superficie del suelo eran intensas y la humedad era baja, aspecto que limitan la germinación de los conidios y el crecimiento del hongo. A profundidad de 5 cm la radiación solar y la temperatura disminuye respecto a la superficie y el nivel de oxigeno es aceptable y la humedad no es óptima pero mayor que en la superficie. En la profundidad de 10 cm se limita el nivel de oxigeno, aspecto importante para el desarrollo de las especies de este género. Al analizar el agroecosistema arboleda el mayor número de aislamientos se obtuvo en la superficie, donde hubo radiación solar directa, temperaturas moderadas, suficiente materia orgánica en descomposición, sin embargo al aumentar la profundidad disminuyen el oxigeno, la temperatura y la materia orgánica, aumenta la humedad, aspecto que frenan el desarrollo de Trichoderma, como ha sido notificado por Villegas (2005) y Paéz (2006).

De los 126 aislamientos de Trichoderma purificados se seleccionaron 72, que cumplían con las condiciones de crecimiento, textura de la colonia y esporulación, los que representan el 57 %. Se decidió iniciar la evaluación con seis de los aislamientos: tres procedentes de la superficie Tb111 (Trichoderma arboleda, campo 1, muestra 1, profundidad 1), Tb211 (Trichoderma arboleda, campo 2, muestra 1, profundidad 1), Tc241(Trichoderma caña, campo 2, muestra 4, profundidad 1) y tres de la profundidad de cinco cm Tb122 (Trichoderma arboleda, campo 1, muestra 2, profundidad 2), Tc112 (Trichoderma caña, campo 1, muestra 1, profundidad 2) y Tc242 (Trichoderma caña, campo 2, muestra 4, profundidad 2).

Entre los aislamientos de Trichoderma obtenidos, la mayoría presentaban colonias de bordes regulares, de crecimiento rápido, entre 7-9 cm de diámetro después de 72 – 96 horas de incubación a una temperatura de 25 ± 1oC, micelio aéreo ralo o flocoso, frecuentemente limitado en el margen de la colonia por un halo de color blanco, lo que coincide con (Páez, 2006) que plantea, que Trichoderma generalmente posee un rápido crecimiento y desarrollo. Las colonias presentan inicialmente un color blanco, tornándose verdosas posteriormente, hasta finalmente adoptar un color de verde azuloso claro a verde más oscuro. Estas observaciones se corresponden con las realizadas por Rodríguez (2002).

La esporulación fue variable, desde conidios que se forman en ramilletes, diseminados por la superficie del medio, con esporulación cerca del borde de la placa Petri, hasta formando halos concéntricos. Resultados similares se han notificado por Piedra (2002), en diferentes aislados de Trichoderma. El reverso de la colonia al inicio es hialino y posteriormente se torna amarillo pálido hasta llegar a amarillo-ocre posterior a las 72 horas. Según Chet (1990), es posible que esta coloración se deba a la producción de enzimas líticas extracelulares, fundamentalmente quitinasas, glucanasas o proteasas.

Al realizar observaciones microscópicas del micelio se detectó la presencia de clamidosporas, aunque el número de las mismas difirió entre aislamientos por ejemplo el aislado Tb111 presentó como promedio 19 clamidosporas, mientras que el Tc241 solo 4,6. Las observaciones realizadas corresponden con las descripciones de aislamientos del género Trichoderma hechas por Rifai (1969) y con las secciones Trichoderma y Longibrachiatum (Gams y Bisset, 1998).

A las 72 horas todos los aislados de Trichoderma crecieron más de la tercera parte de la superficie de la placa, lo que los sitúa en la clase 2 de la escala de Bell et al. (1982), excepción hacen los aislamientos Tb111 y Tc 241 que se desarrollaron en toda la placa, lo que hizo que se ubicaran en la clase 1. Estos aislados poseen la mayor velocidad de crecimiento (1,25mm/h), pues ya a las 72 h habían cubierto toda la superficie del medio de cultivo. Estos aislamientos muestran casi el doble del crecimiento que presenta el aislado estándar (Ts3). No obstante, todos los aislamientos pueden ser considerados como antagonistas según Bell et al. (1982). (Tabla 3).

Los aislamientos de Trichoderma en el enfrentamiento a Rhizoctonia manifiestan una menor acción como competidores por el sustrato, que para el caso de Sclerotium; inclusive la velocidad de crecimiento de Trichoderma es inferior estando relacionado con la existencia de una interacción a distancia entre los dos hongos, que origina que el efecto antagonista de Trichoderma sea menor (tabla 4).

El aislamiento Tc241 presenta colonias de crecimiento rápido (1,25 mm/h), con una coloración que pasó de verde claro azuloso a verde azuloso oscuro, reverso de la colonia amarillo pálido, el micelio septado (con ancho de 1,63-5,60 µm), conidióforos largos (76,60-172,72 µm), con cortas ramificaciones, las fiálides son lageniformes, pueden estar en solitario, pareadas y en raras ocasiones en verticilios de tres, con tamaños que van desde 17,04-23,57 x 4,67-8,87µm, además presenta fiálides terminales mayores de 14 µm con fiálides intercalares por debajo de la fiálide terminal. Los conidios son lisos, de globosos a elipsoidales con tamaño de 2,63-5,50 x 1,79-3,47 µm, presencia de clamidosporas con dimensiones de 5,86-11,96 µm. De acuerdo a esta caracterización este aislamiento coincide con T. longibrachiatum (Gams y Bisett, 1998).

 

CONCLUSIONES

1. El mayor número de aislamientos en el agroecosistema arboleda se obtuvo en la superficie y en caña hasta 5 cm de profundidad con 29 y 27 aislamientos respectivamente.

2. Se dispone de dos cepas de Trichoderma identificadas como Trichoderma harzianum y Trichoderma longibrachiatum; autóctonas del municipio de Colón, provincia de Matanzas.

3. Las cepas de Trichoderma estudiadas manifestaron un alto potencial antagonista ante Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp comparadas con el aislado estándar Ts3.